Los virus de transmisión alimentaria, o virus entéricos, se encuentran entre los principales riesgos sanitarios asociados al consumo de alimentos, y por ende repercuten en la seguridad alimentaria. Recientemente la organización mundial de la salud ha elaborado un informe según el cual anualmente se producen 120 millones de casos de gastroenteritis causada por norovirus humanos (NoV) (véase World Health Organization). Los virus entéricos son responsables de diversas patologías: desde gastroenteritis, normalmente leves, hasta patologías más graves como hepatitis agudas, miocarditis o incluso meningitis o encefalitis aséptica. En los últimos años, se ha producido un aumento en el número de brotes de transmisión alimentaria causados por estos patógenos. Esto supone un importante problema de salud pública, ocasionando graves complicaciones sanitarias en algunos grupos de población, como personas inmunodeprimidas o ancianos, además de tener importantes repercusiones económicas.

Los virus que más preocupan hoy en día en el ámbito de la seguridad alimentaria son los NoV, el virus de la hepatitis A (VHA), y más recientemente el virus de la hepatitis E (VHE) que causan cuadros de hepatitis agudas, y este último en algunos casos puede llegar a evolucionar hasta hepatitis crónica. Además, las embarazadas con hepatitis E, presentan mayor riesgo de insuficiencia hepática aguda y de muerte propia y del feto. En el tercer trimestre del embarazo se han registrado tasas de letalidad de hasta un 20-25%.

Otros virus causantes de gastroenteritis como los sapovirus, rotavirus, adenovirus, astrovirus, Aichi virus, parvovirus y picobirnavirus han sido esporádicamente asociados al consumo de alimentos contaminados.

Según los últimos datos publicados en Estados Unidos y en Europa, los NoV son los responsables etiológicos del 36 % y 7,8 % de los brotes de transmisión alimentaria, y se sitúan entre los cinco patógenos responsables de las enfermedades de transmisión alimentaria que suponen un mayor coste económico (EFSA and ECDC, 2018). En Europa, en el periodo 2017-2018 el sistema de alerta rápida para alimentos y piensos ha informado de 86 alertas de contaminación por virus entéricos (https://webgate.ec.europa.eu/rasff-window/portal/?event=SearchForm&cleanSearch=1), 81 (94%) de ellas causadas por NoV y 5 (6%) por VHA. Los alimentos involucrados han sido mayoritariamente los moluscos bivalvos (73%), junto con los frutos rojos (23%) y las hortalizas (4%).

Los virus entéricos son transmitidos principalmente por la vía fecal-oral y, por tanto, pueden estar potencialmente presentes en alimentos que hayan sufrido contaminación directa con materia fecal, o a través de aguas contaminadas. Los principales alimentos involucrados en infecciones víricas transmitidas por alimentos son los moluscos bivalvos, las verduras y ensaladas, las frutas tipo baya, así como también los alimentos preparados y listos para su consumo que hayan sido contaminados por manipulación incorrecta después de su preparación o cocinado. Por otra parte, recientemente se ha demostrado un aumento de la incidencia de casos de hepatitis E asociados al consumo de carne cruda o poco cocinada de cerdo y jabalí procedente de animales infectados (Kupferschmidt, 2016).

La importancia de los virus entéricos en el campo de la seguridad alimentaria se pone de manifiesto por el interés mostrado por distintos organismos internacionales. Entre ellos destaca la comisión del Codex Alimentarius, que publicó un documento sobre la importancia de los virus de transmisión alimentaria. En dicho documento se pone de manifiesto la importancia de desarrollar ciertos aspectos científicos y técnicos con la finalidad de reducir las infecciones víricas transmitidas por los alimentos. En el plan estratégico a seguir se menciona la necesidad de desarrollar métodos rápidos de diagnóstico, estudios para establecer la correlación entre infectividad y detección molecular, y finalmente estudios sobre la efectividad de los procesados alimentarios para la inactivación de virus entéricos (CX/FH 08/40/9). En este sentido, la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) también ha publicado diversas directrices sobre la relevancia y el control de virus en alimentos; en línea con las directrices sobre principios generales de higiene para el control de virus en alimentos (CX/FH 10/42/5) elaboradas por la comisión Codex. En estos documentos se subraya que el control de los riesgos en alimentos debe empezar durante la producción agrícola o animal y continuar durante toda la cadena alimentaria (“de la granja a la mesa”). En este aspecto, los virus de transmisión alimentaria requieren especial atención debido a que se comportan de manera diferente a los patógenos bacterianos, y a que las medidas de control implementadas actualmente en la industria alimentaria no han sido evaluadas o no son efectivas para la inactivación de virus entéricos. En el campo de la seguridad microbiológica de los alimentos es necesario, por tanto, conocer el riesgo real que supone la presencia de los virus entéricos en los alimentos, así como aquellas condiciones que garanticen la seguridad microbiológica del alimento.

Para poder controlar la contaminación vírica de alimentos, es necesario el desarrollo de metodologías que permitan determinar la reducción de virus infecciosos presentes en alimentos después de aplicar tratamientos de conservación. Este hecho pasa por el uso de cultivos celulares o modelos animales, lo cual restringe mucho el rango de virus a estudiar. Esto es especialmente importante para los NoV y las cepas silvestres del VHA y del VHE, que no replican fácilmente en cultivos celulares y por ende dificultan los estudios de inactivación. Por ello, el uso de cepas adaptadas a cultivo celular o virus sustitutos, como el calicivirus felino (FCV), el norovirus murino (MNV) y el virus Tulane, se han utilizado de forma extensiva para este tipo de estudios. Para realizar este tipo de trabajos, de manera general, se llevan a cabo ensayos donde se inoculan concentraciones conocidas de virus en la muestra, observando la reducción de dicha concentración después del tratamiento.

La detección de virus entéricos es especialmente compleja ya que la mayoría de estos patógenos no replican fácilmente en cultivos celulares, en general se encuentran en concentraciones muy bajas, la contaminación vírica no es uniforme y los virus entéricos pueden encontrarse internalizados en verduras de hoja.

La detección de virus en alimentos se ha visto incrementada exponencialmente en los últimos años, estableciéndose métodos de detección basados en técnicas moleculares, principalmente RT-qPCR cuya normalización (ISO 15216-1:2017 e ISO/TS 15216-2:2013) y validación (Lowther et al., 2019) en determinadas matrices (agua embotellada, superficie de alimentos, moluscos bivalvos, frutos rojos y verduras de hoja verde) han sido recientemente publicadas para NoV GI y GII, y VHA. Desafortunadamente, hasta la fecha no existen métodos estandarizados para la detección y cuantificación del VHE en muestras de alimentos, a pesar de ser una de las prioridades establecidas recientemente por la agencia europea de seguridad alimentaria (Ricci et al., 2017).

El análisis de virus en alimentos consiste en una etapa inicial de separación de los virus de la matriz alimentaria, seguida de la concentración de virus y purificación, diseñada para reducir el volumen de muestra y eliminar algunos de los compuestos de la matriz mientras que simultáneamente se recupera la mayor parte de los virus contaminantes (Bosch et al., 2011). Posteriormente se realiza la extracción de ácidos nucleicos, y detección y cuantificación mediante RT-qPCR. Alternativamente la PCR digital, que no depende de materiales de referencia o estándares para la cuantificación de la muestra, se ha empezado a utilizar en el campo de la virología de alimentos (Fraisse et al., 2017; Persson, Eriksson, Lowther, Ellström y Simonsson, 2018; Varela, Monteiro, Rivadulla, Santos y Romalde, 2018).

La metodología descrita en las ISO 15216-1:2017 e ISO/TS 15216-2:2013 incluye diversos controles para evaluar la presencia de inhibidores y determinar la eficacia del proceso de extracción mediante el uso de un control de proceso, generalmente el mengovirus. Todo ello hace que el análisis de virus en alimentos tenga un coste económico elevado. A pesar de esto, el método ISO se está utilizando en laboratorios de control de aguas y alimentos; y actualmente diversos laboratorios nacionales han acreditado estos procedimientos por la entidad nacional de acreditación (ENAC). Además, en los últimos años estos procedimientos están siendo utilizados a nivel fronterizo para la inspección de alimentos de riesgo por contaminación vírica aunque a día de hoy no hay legislación que regule los niveles permitidos de virus en alimentos. En esta línea la EFSA ha organizado un estudio para determinar los niveles de NoV en moluscos bivalvos con el fin de poder establecer los límites permitidos para norovirus (EFSA, 2019).

Por otro lado, estos métodos son rápidos, sensibles y altamente específicos, pero al detectar genomas no son capaces de diferenciar entre virus infecciosos y no infecciosos, y ello dificulta enormemente la interpretación de un resultado positivo en términos de análisis de riesgo. Con el fin de obtener una mejor correlación entre la detección por RT-qPCR y la infectividad de la muestra se han investigado distintas aproximaciones: i) recuperación de NoV potencialmente infecciosos unidos selectivamente a mucina gástrica porcina; ii) tratamientos con nucleasas y enzimas proteolíticas antes de la extracción para eliminar cualquier señal de cápsides dañadas; iii) PCR de fragmentos largos; iv) tratamientos con reactivos de viabilidad, ya sea con un paso de fotoactivación (por ejemplo, propidio y etidio de monoazida, PMA o EMA) o sin fotoactivación (por ejemplo, compuestos de platino y paladio). Esta última aproximación, la PCR de viabilidad, se ha descrito para distintos virus entéricos inactivados por calor, tratamiento con cloro, luz ultravioleta o altas presiones (véase tabla 2), y en los últimos años se han utilizado para la detección de estos patógenos en muestras de contaminación natural, principalmente en muestras de agua residual, superficial o embotellada y en ostras (Fuster et al., 2016; López-Gálvez et al., 2018; Prevost et al., 2016; Randazzo, Khezri et al., 2018; Randazzo, Vasquez-García, Aznar y Sánchez, 2018). Aunque los pretratamientos con reactivos de viabilidad reflejan mejor los patrones de inactivación vírica, la correlación con la infectividad sigue sin ser absoluta, dependiendo del virus o del tratamiento de inactivación aplicado. A pesar de ello, incorporar estas metodologías en los análisis de rutina permitirá una cuantificación más precisa de los virus infecciosos presentes en los alimentos, constituyendo una herramienta muy útil para la evaluación de riesgos.

En la última década se ha extendido el uso de tecnologías de secuenciación masiva para el estudio de la diversidad vírica, o estudio de viromas. Los estudios metagenómicos pueden utilizarse para el control tanto de los ambientes relacionados con la producción de alimentos (industria alimentaria, acuicultura...), como para el control de los propios alimentos y de los posibles brotes producidos por su consumo que nos permitirían conocer tanto las posibles cepas responsables de brotes como las tendencias en la aparición de determinados virus y la detección de nuevos virus emergentes (Nieuwenhuijse y Koopmans, 2017). El uso de la secuenciación masiva en el estudio de brotes víricos relacionados con el consumo de agua y alimentos permite, además, la detección de todos los virus mediante un único protocolo y proporciona información adicional para el trazado epidemiológico. Su uso en la cadena de producción alimentaria también presenta un gran potencial, debido a la elevada sensibilidad y rango de detección (Aarestrup et al., 2012). En la tabla 3 se resumen los diferentes estudios de metagenómica vírica en alimentos que se han realizado hasta la fecha. Algunos de ellos se han dirigido únicamente a la secuenciación de virus de ADN (Park et al., 2011) o ARN (Yang et al., 2017), mientras que otros han analizado la presencia de virus con ambos tipos de material genético (Aw, Wengert y Rose, 2016; Bartsch, Höper, Mäde y Johne, 2018; Fernandez-Cassi et al., 2017).

Sin embargo, las técnicas de secuenciación masiva todavía presentan ciertas dificultades relacionadas con la preparación y secuenciación de las muestras, el análisis de los datos y la interpretación de los mismos (Nieuwenhuijse y Koopmans, 2017). El principal problema a la hora de preparar una muestra para el análisis del viroma reside en la necesidad de reducir el material genético de la porción no vírica de la muestra. En la actualidad, diferentes aproximaciones están siendo evaluadas para obtener una mayor purificación del material genético vírico, tales como el uso de diferentes protocolos de extracción (Conceição-Neto et al., 2015; Cotten et al., 2014) o el uso de sondas para capturar virus (Briese et al., 2015). La elección de la plataforma de secuenciación también supone un problema en la estandarización de los estudios de metagenómica de virus. La elección de dicha plataforma debe realizarse teniendo en cuenta tanto el coste por nucleótido como el número de secuencias y el tamaño de estas. Una vez obtenidas las secuencias, el siguiente aspecto que hay que tener en cuenta es el análisis de los resultados. En este aspecto, tanto la infraestructura necesaria como el uso de un determinado programa de ensamblaje y la asignación de las secuencias suponen un problema en estos estudios. Por un lado, el análisis del elevado número de secuencias que proporcionan las técnicas de secuenciación masiva supone una fuerte inversión económica. Además, este análisis requiere personal especializado que sepa manejar diferentes programas y plataformas informáticas. Por último, la asignación de estos metagenomas a un determinado grupo vírico depende de las bases de datos utilizadas. En este aspecto, el mayor problema reside en la presencia de secuencias mal anotadas en algunas bases de datos o en que estas bases de datos están incompletas. Es por ello que la anotación de los metagenomas quedará supeditada al uso de la base de datos, teniendo que elegir entre bases de datos pequeñas y de alta calidad que proporcionen un menor número de resultados, o grandes bases de datos pero de menor calidad que proporcionarán un mayor número de resultados. Por ello, el uso de estos resultados debe realizarse con discreción cuando sean utilizados para aplicaciones de vigilancia y diagnóstico (Nieuwenhuijse y Koopmans, 2017). Además, los resultados obtenidos deben interpretarse teniendo en cuenta tanto el contenido vírico típico de la muestra de estudio como la capacidad infectiva del mismo, ya que la presencia de un fragmento de determinado genoma vírico no siempre implica la capacidad de infección del mismo. Todos estos aspectos técnicos evidencian la necesidad de mejorar y estandarizar los métodos utilizados en los estudios víricos mediante secuenciación masiva.