La seguridad alimentaria sigue representando una de las principales preocupaciones en el campo de la salud pública debido principalmente al considerable número de toxiinfecciones transmitidas por los alimentos. En general, se estima que en el mundo se producen cerca de 9.4 millones de toxiinfecciones alimentarias (TIAs), las cuales causan 55.961 hospitalizaciones y 1.351 muertes al año. Estas TIAs son provocadas por muchos tipos de microorganismos pero fundamentalmente por bacterias como son Campylobacter, Salmonella, Escherichia coli patogénica y Listeria monocytogenes entre otras (Ding et al., 2017). Los productos vegetales frescos suponen un importante vehículo de transmisión de estas bacterias y su incidencia en humanos ha aumentado en los últimos años. Muchos son los factores que se han identificado como responsables de ese incremento en el número de TIA asociadas a los alimentos frescos, entre las que se pueden mencionar los cambios en la alimentación y en el estilo de vida, que ha provocado un aumento en el consumo de vegetales frescos, así como la mejora de los programas de vigilancia y las técnicas de detección de los microorganismos patógenos (EFSA, 2013; véase también European Commission Notice No. 2017/C 163/01).

Las autoridades competentes, tales como la Comisión Europea (CE) en Europa y la Food and Drug Administration (FDA) en Estados Unidos, han elaborado guías de recomendaciones y legislación en las que se incluye la monitorización de las aguas de riego, con el fin de evitar riesgos microbiológicos que puedan provocar TIA asociadas a productos vegetales. Asimismo, la legislación europea incluye límites microbiológicos para las frutas y hortalizas listas para su consumo, lo que hace necesario detectar y cuantificar los microorganismos patógenos e indicadores que pueden estar presentes en los productos vegetales (véase Commission Regulation (EC) No 2073/2005 of 15 November 2005; European Commission Notice No. 2017/C 163/01; FSMA Final Rule on Produce Safety).

Tradicionalmente, para detectar y cuantificar la presencia de bacterias patógenas o, en su lugar, microorganismos indicadores de contaminación fecal, se utilizan técnicas dependientes de cultivo. Sin embargo, numerosos estudios han evidenciado que los recuentos basados en métodos de cultivo en placa no dan una buena estimación del número real de microorganismos presentes en los alimentos. Durante la producción y procesado, los alimentos se someten a numerosas etapas que pueden constituir un estrés para las bacterias. Las bacterias pasan entonces de un estado totalmente activo y cultivable a un estado de latencia, denominado viable pero no cultivable (VBNC). Los cambios de temperatura, el uso de desinfectantes y los tratamientos con luz-UV son algunos de factores causantes de estrés a las bacterias y que los estudios científicos han asociado con una inducción al estado VBNC de los microorganismos presentes en los alimentos (Ding et al., 2017; Dinu y Bach, 2011; Zhang, Ye, Lin, Lv y Yu, 2015). El estado VBNC fue descubierto en el año 1982 por Xu et al. (1982), y define a aquellas bacterias que no pueden desarrolladas en un medio de cultivo pero que siguen metabólicamente activas. A pesar de que estas bacterias no son cultivables, pueden representar un peligro para los consumidores, ya que hay evidencias científicas de que estas bacterias pueden revertir este estado a un estado metabólicamente activo cuando se encuentran en condiciones favorables de crecimiento, pudiendo desarrollar su patogenicidad (Highmore, Warner, Rothwell, Wilks. y Keevil, 2018). Hasta el momento, no existes evidencias científicas que confirmen que los brotes de TIA descritos en los últimos años hayan sido provocados por bacterias patógenas en estado de VBNC. Sin embargo, algunos estudios han intentado demostrar que la presencia de bacterias patógenas en estado VBNC han podido ser la causa de algunas de las TIA. Por ejemplo, Makino et al. (2000) establece una relación entre un brote de TIA ocurrido en Japón asociado al consumo de salmón y la presencia de la bacteria Escherichia coli O157:H7 en estado VBNC debido al proceso de salado al que se somete el salmón.

Con respecto a las TIA ocurridas por el consumo de vegetales, Zhao, Zhong, Wei, Lin y Ding (2017), sugieren que Escherichia coli O104:H4, responsable de la toxinfección en Alemania en el año 2011, no pudo ser detectada ni aislada de la fuente de contaminación porque se encontraba en un estado VBNC. Esta teoría está apoyada por las investigaciones realizadas por Aurass, Prager y Flieger (2011) que confirmaron que la cepa de Escherichia coli O104:H4 que generó la TIA en Alemania entró en un estado de VBNC por los iones de cobre que posee el agua potable de esa zona, y que cuando el estrés remitió, la bacteria resucitó manteniendo su patogenicidad. Además, también se ha demostrado que la bacteria Escherichia coli O157:H7 en estado VBNC, continúa expresando sus factores de virulencia una vez es inoculada sobre lechuga (Dinu y Bach, 2011). Por lo tanto, existe una necesidad de investigar la relevancia en la seguridad alimentaria del estado fisiológico de las bacterias, y más concretamente qué capacidad de patogenicidad tienen las bacterias que se encuentran en el estado VBNC en los alimentos. Asimismo, se necesita más investigación centrada en el desarrollo y optimización de métodos rápidos de detección que nos permitan determinar el estado fisiológico de las bacterias para poder mejorar la seguridad alimentaria.

Varios estudios han demostrado que cuando las bacterias, incluidas las bacterias patógenas de alimentos, son sometidas a un estrés entran en un estado temporal de baja actividad metabólica en el cual las células pueden persistir durante largos periodos de tiempo sin división celular, llamado latencia (Oliver, 2010). En las bacterias no esporuladas existen dos estados de latencia: las células viables no cultivables (VBNC) y las células llamadas persistentes (persister cells) (Ayrapetyan, Williams, Baxter y Oliver, 2015). Aunque comparten algunas similitudes, las células VBNC no se dividen, sino que mantienen sus membranas celulares intactas, continúan con la expresión génica y tienen la capacidad de convertirse en cultivables una vez resucitadas. Sin embargo, las condiciones y los medios de cultivo utilizados en la microbiología clásica no cumplen con los requisitos de estos organismos para reanudar su crecimiento inmediatamente (Zhao et al., 2017). La mayoría de las especies bacterianas son capaces de entrar en un estado VBNC cuando se encuentran en condiciones ambientales adversas, lo que incluye la exposición a biocidas que son utilizados frecuentemente en la industria alimentaria, lo que indica que el estado VBNC puede ser una fase habitual en el ciclo de vida de la bacteria (Oliver, 2005). Por otro lado, las células persistentes son células de crecimiento lento o subpoblaciones que no crecen dentro de un cultivo y que poseen tolerancia a distintos compuestos antimicrobianos, por lo que pueden sobrevivir a los mismos, mientras que el resto de la población sigue siendo sensible. Estas bacterias resistentes son capaces de reanudar el crecimiento cuando se encuentran en un medio que dispone de los nutrientes necesarios y las condiciones adecuadas para el mismo (Nyström, 2003).

Por lo tanto, las bacterias en estado VBNC se caracterizan principalmente por: (i) mantener la integridad celular; (ii) poseer alguna forma de actividad celular medible (Lai, Chen, Lin, Chang y Wong, 2009); (iii) tener la capacidad de recuperarse (Anuchin et al., 2009); (iv) responder a estímulos externos que se demuestran mediante la expresión génica (Kell,, Kaprelyants, Weichart, Harwood y Barer, 1998); (v) tener baja actividad metabólica (Oliver, 2005); (vi) presentar enanismo (Costa et al., 1999); (vii) tener reducido el transporte de nutrientes; (viii) tener un alto nivel de ATP y mostrar un alto nivel de potencial de membrana (Signoretto, Lleo y Canepari, 2002); (ix) presentar modificaciones en la composición de ácidos grasos de las membranas citoplasmáticas (Day y Oliver, 2004); así como (x) tener una mayor resistencia a los antibióticos debido a una actividad metabólica más baja (Oliver, 2010).

Como hemos indicado anteriormente, el estado VBNC puede ser desencadenado por circunstancias de estrés como duras condiciones ambientales (Oliver, 2010), escasez de nutrientes (Cook y Bolster, 2007) temperaturas extremas (Besnard, Federighi, Declerq, Jugiau y Cappelier, 2002), fuertes cambios de pH o salinidad (Cunningham, O’Byrne y Oliver, 2009); estrés osmótico (Asakura et al., 2008), disponibilidad de oxígeno (Kana et al., 2008; Mascher, Hase, Moenne-Loccoz y Défago, 2000), y daño o perdida de componentes esenciales de la célula incluido el ADN por la exposición a metales pesados, conservantes o luz UV (Fakruddin, Bin Mannan y Andrews, 2013). Además, durante el procesado de alimentos, existen numerosos factores que pueden inducir a las células al estado VBNC tales como los tratamientos térmicos, el uso de antibacterianos como fagos lisogénicos, autolisinas y los procesos de desinfección (Nicolò y Guglielmino, 2012; Oliver, 2010).

Pese a todos los estudios que se han llevado a cabo con el objetivo de esclarecer la relevancia de este estado en la seguridad alimentaria, el estado VBNC continúa estando en entredicho debido a las dificultades que existen para diferenciar las células VBNC y las células latentes a través de reanimación y estudios fenotípicos. Sin embargo, recientemente, avances en las técnicas moleculares que se pueden utilizar con este fin están generando información muy valiosa que va a poder ser utilizada para clarificar la relevancia del estado VBNC.

La no culturabilidad de las bacterias en el estado VBNC constituye un problema para la seguridad alimentaria y para la salud pública, ya que alimentos que a priori pueden parecer libres de bacterias patógenas pueden contener células en estado VBNC, capaces de resucitar y de causar la enfermedad. Esto es debido a que las células VBNC no son detectadas mediante las técnicas convencionales de cultivo en placa. En la literatura científica existen opiniones controvertidas con respecto a si las bacterias que se encuentran en estado VBNC todavía retienen su patogenicidad. Por un lado, existen evidencias científicas que indican que algunas bacterias patógenas en estado VBNC pueden expresar sus factores de virulencia, por lo que su capacidad de infección puede recuperarse si el estado VBNC es revertido (Anderson et al., 2004; Highmore et al., 2018; Pommepuy et al., 1996). Sin embargo, otros estudios apuestan por que los microorganismos en el estado VBNC no son capaces de comenzar una infección (Cappelier, Besnard, Roche, Velge y Federighi, 2007; Habimana et al., 2014).

Dinu y Bach (2011) observaron que en la superficie de los vegetales, las células de Escherichia coli O157:H7 eran inducidas al estado VBNC debido a las bajas temperaturas. Sin embargo, estas bacterias ubicadas en la filósfera de la lechuga, seguían siendo metabólicamente activas, ya que fueron capaces de producir pequeñas cantidades de verotoxinas. Posteriormente Van der Linden et al. (2014) demostraron que las células de Escherichia coli O157:H7 sometidas a determinadas circunstancias de estrés eran capaces de recuperarse y atacar la superficie de la lechuga sobre la que se inocularon. Recientemente Highmore et al. (2018) han puesto de manifiesto que las células de Listeria monocytogenes en el estado VBNC inducido por los tratamientos de cloro que se usan para la desinfección del agua durante el lavado de los vegetales eran capaces de mantener su patogenicidad cuando fueron ingeridas por el nematodo Caenorhabditis elegans. Los investigadores observaron la presencia del patógeno en el lumen intestinal de Caenorhabditis elegans, lo que indica su capacidad de resucitación e invasión celular tras su ingestión. Todos estos estudios subrayan el riesgo que pueden representar para la salud pública los patógenos en estado VBNC transmitidos por los alimentos.

La presencia de bacterias en estado VBNC en muestras ambientales, principalmente en agua, está ampliamente demostrada en la literatura científica (Gensberger et al., 2014; Li et al., 2014; Van Frankenhuyzen, Trevors, Flemming, Lee y Habash, 2013). Sin embargo, pocos estudios se han centrado en evaluar la presencia de células en estado VBNC en el tejido vegetal durante la producción o el procesado. En general, se ha descrito que la presencia de bacterias viables en el tejido vegetal suele estar comprendida entre 1 - 4 unidades logarítmicas superior al número de células cultivables (véase figura 2).

En un estudio en cámaras de cultivo controlado, Moyle et al. (2013) inocularon plantas de lechuga romana con 10⁶ CFU/por hoja de Escherichia coli O157:H7 y estudiaron su viabilidad durante siete días. La cuantificación de Escherichia coli O157:H7 con PMA-qPCR y con la técnica de recuento en placa mostró que la mayoría de las células del patógeno presentes en el tejido vegetal se encontraban es estado VBNC. Utilizando la técnica del PMA-qPCR para la cuantificación de células VBNC, Truchado et al. (2016) determinaron que en lechuga iceberg, la concentración de Escherichia coli en estado VBNC era dos unidades logarítmicas superior a la cantidad de Escherichia coli cultivable. La lechuga había sido regada con agua superficial de baja calidad en la que se habían cuantificado 6 log ufc/100 mL de Escherichia coli en estado VBNC y 4 log ufc/100 mL de cultivables. Resultados similares han sido recientemente publicados por Tombini-Decol et al. (2019) en lechuga baby pigmentada regada durante todo su ciclo de cultivo con agua regenerada del tratamiento secundario de la depuradora. Los resultados muestran una diferencia de aproximadamente dos unidades logarítmicas entre los recuentos de Escherichia coli viable y los de Escherichia coli cultivable en el tejido vegetal. La presencia de VBNC presentes en el tejido vegetal fueron atribuidas al estrés medioambiental y al tratamiento de desinfección aplicado al agua de riego.

Estos estudios científicos ponen de manifiesto la relevancia del estado fisiológico de las bacterias en el tejido vegetal, ya que las células en estado VBNC podrían revertir este estado al de cultivable y desarrollar su patogenicidad con el consiguiente riesgo para la salud pública, tal y como se ha indicado anteriormente. Por estas razones, es importante seguir profundizando en el estado fisiológico de las bacterias presentes en los productos vegetales frescos y en cómo las distintas prácticas agrícolas, las condiciones climatológicas y el procesado pueden afectar al estado de las mismas.