El consumo de frutas y hortalizas es beneficioso para la salud por su contenido en vitaminas, minerales, fibras y sustancias fitoquímicas, que contribuyen a la salud. Asimismo, su consumo puede llegar a reducir el riesgo de mortalidad por enfermedades cardiovasculares y cáncer (Wang et al., 2014).

Las frutas y hortalizas mínimamente procesadas surgen como respuesta a la demanda del consumidor de productos frescos, sanos, de elevada calidad y que requieran escaso tiempo de preparación conservando sus propiedades originales desde el punto de vista organoléptico y nutritivo. Según valoraciones del año 2017 (véase “La IV gama de frutas y hortalizas espera crecer un 10 % hasta 2020”), en España, el consumo de este tipo de productos ronda los 3 kg per cápita/año. Aunque la demanda no es muy alta, en nuestro país más del 70 % de los hogares ha incorporado en alguna ocasión estos productos a la cesta de la compra. De hecho, la industria de IV gama ha crecido continuamente desde su introducción en el mercado español en 1989 y se estima que, para el año 2020, la venta al por menor de productos mínimamente procesados crecerá entre un 8 y un 10 %, alcanzando los 320.000 millones de euros en ventas (véase “La IV gama de frutas y hortalizas espera crecer un 10 % hasta 2020”).

Las frutas y hortalizas mínimamente procesadas son frutas y hortalizas frescas, limpias, troceadas y envasadas, listas para su consumo, con una fecha de caducidad en torno a los 5-7 días conservadas entre 1-4 °C, que garantizan su seguridad y calidad nutricional y sensorial. El procesado de elaboración de productos de IV gama incluye operaciones como el pelado y el corte, que producen estrés físico en el vegetal y darán lugar a la liberación de fluidos celulares, causando alteraciones fisiológicas y microbiológicas que pueden repercutir en la calidad y vida útil del producto obtenido. En este sentido, uno de los principales retos para la industria de IV gama es la búsqueda de estrategias que permitan conservar la calidad de las frutas y hortalizas cortadas, alargar su vida útil y, sobre todo, garantizar su seguridad.

La microbiota natural de frutas y hortalizas frescas no suele ser patógena para los humanos. Sin embargo, durante el cultivo, la cosecha, el transporte y el posterior procesado y manejo, el producto puede contaminarse con patógenos de transmisión alimentaria, ya sean de origen humano, animal o ambiental (Sánchez, Elizaquível y Aznar, 2012). Esta contaminación con patógenos de transmisión alimentaria plantea un posible problema de seguridad alimentaria, ya que los productos mínimamente procesados se consumen crudos, sin ningún tipo de tratamiento microbiológicamente letal. Por todo ello, para evitar y minimizar los riesgos de contaminación de las frutas y hortalizas, es necesario llevar a cabo unas Buenas Prácticas de Producción y de Fabricación y aplicar un sistema de Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico (APPCC).

En el año 2017 se detectaron 39 brotes de toxiinfección alimentaria asociados al consumo de alimentos de origen no animal en la Unión Europea, lo que representa el 6,1 % de los brotes, siendo Salmonella spp. y los Calicivirus, incluyendo los norovirus los principales agentes causales, seguidos de las toxinas bacterianas y de Escherichia coli, productor de Shigatoxina (EFSA and ECDC, 2018). Asimismo, el número de brotes de toxiinfecciones alimentarias causadas por la ingesta de productos mínimamente procesados se sitúa en una tasa bastante alta tanto en Estados Unidos como en la Unión Europea.

Por lo tanto, los métodos de producción seguros y los procedimientos adecuados de descontaminación son pasos críticos para garantizar la seguridad de las frutas y hortalizas frescas listas para el consumo (Artés, Gómez, Aguayo, Escalona y Artés-Hernández, 2009). El lavado de los productos vegetales con agua elimina suciedad, exudados y células muertas que contribuyen al deterioro de la fruta. Sin embargo, para eliminar o reducir la microbiota presente se suelen emplear desinfectantes químicos, con los que además se evita la contaminación cruzada entre productos limpios y contaminados. De hecho, su efecto principal es mantener la calidad microbiana del agua (Gil, Selma, López-Gálvez y Allende, 2009). Aunque el uso de desinfectantes químicos es habitual en la industria de IV gama, los consumidores tienen una percepción negativa de los mismos, ya que algunos de ellos están relacionados con la producción de compuestos tóxicos, y además precisan períodos de tiempo bastante largos para degradarse, creando problemas de contaminación ambiental (Faleiro, 2010). Por ese motivo se buscan alternativas para el control de microorganismos e incrementar la seguridad alimentaria.

En las alternativas para mejorar la seguridad de estos productos, encontramos una gran variedad de métodos físicos, como por ejemplo la luz ultravioleta (UV-C), la alta presión hidrostática, los ultrasonidos y la irradiación, entre otros (Ramos, Miller, Brandao, Teixeria y Silva, 2013). Sin embargo, la mayoría de estas técnicas todavía no están implantadas en la industria, siendo el envasado en atmósfera modificada y la refrigeración los métodos físicos más ampliamente aplicados, ya que su combinación evita el desarrollo de microorganismos y retarda la senescencia del producto, alargando la vida útil de las frutas y hortalizas de IV gama.

Otra de las alternativas es la bioconservación, ya sea mediante el uso de microorganismos o sus metabolitos. Estos cultivos protectores ejercen su función ocupando el mismo nicho que los patógenos (compitiendo por espacio y nutrientes), produciendo sustancias antimicrobianas, y en caso de algunas bacterias, como las probióticas, actuando a nivel del intestino impidiendo que los patógenos se adhieran e invadan los enterocitos y activando una respuesta inmunitaria como barrera defensiva contra los patógenos (Fliss, Hammami y Le Lay, 2011). Sin embargo, la bioconservación no sustituye el uso de buenas prácticas de higiene, de forma que siempre se debe considerar como un parámetro adicional para mejorar la seguridad y la calidad del producto (Holzapfel, Geisen y Schillinger, 1995).

Los cultivos protectores pueden evitar el crecimiento de patógenos de transmisión alimentaria en frutas y hortalizas mínimamente procesadas o pueden incluso ser una alternativa a los tratamientos químicos habituales en la industria de IV gama. Pueden realizarse mediante la utilización de microorganismos previamente existentes en el alimento o mediante la introducción artificial de microorganismos con capacidad de controlar a los patógenos (Leverentz et al., 2003).

Como ya se ha comentado, uno de los mecanismos de acción por los cuales los cultivos bioconservantes pueden controlar microorganismos alterantes o patógenos en los alimentos es la producción de metabolitos como las bacteriocinas. Las bacteriocinas son péptidos con actividad antimicrobiana producidos por un gran número de bacterias (Cotter, Hill y Ross, 2005). Principalmente actúan sobre la membrana de las células sensibles, desestabilizando y permeabilizando mediante la formación de canales. Se clasifican según sus características bioquímicas y genéticas, diferenciando bacteriocinas de tipo I, II, III y IV (Mondragón Preciado et al., 2013). Es importante destacar que las bacteriocinas son compuestos seguros para los humanos debido a que las proteasas presentes en el tracto gastrointestinal humano las descomponen en sustancias no tóxicas (Chen y Hoover, 2003).

La aplicación de las bacteriocinas como método de bioconservación se ha estudiado ampliamente en productos de origen animal; sin embargo, su aplicabilidad en productos vegetales todavía está en estudio. La termorresistencia de estos compuestos los convierte en un bioconservante ideal para la industria productora de vegetales enlatados o zumos tratados térmicamente (Komitopoulou, Boziaris, Davies, Delves-Broughton y Adams, 1999), siendo su capacidad de permanecer activas en ambientes ácidos (McAuliffe, Ross y Hill, 2001) lo que las hace interesantes como bioconservante en el sector de frutas y hortalizas mínimamente procesadas.

Existen distintos métodos que pueden emplearse para que las bacteriocinas lleguen a los alimentos y actúen como bioconservantes. Uno de ellos es la adición del cultivo microbiano productor de bacteriocina a la matriz alimentaria, produciéndose de este modo las bacteriocinas in situ (Gragg y Brashears, 2010; Siroli et al., 2016) mientras que, por otro lado, puede cultivarse el microorganismo productor de bacteriocina en condiciones controladas para conseguir un purificado que contenga parcial o exclusivamente este compuesto que se podrá aplicar directamente en el alimento. Debido a que se ha descrito que la producción de bacteriocinas puede ser dependiente de la temperatura (Bennik, van Overbeek, Smid y Gorris, 1999), la aplicación directa del compuesto en el alimento permite tener un mayor control sobre la concentración de bacteriocina presente en el alimento y una distribución más homogénea del compuesto en el producto.

La nisina, bacteriocina producida por Lactococcus lactis subsp. lactis, es una de las bacteriocinas más estudiadas como bioconservante en frutas y hortalizas. Esta bacteriocina está aprobada como aditivo alimentario (E-314) y se comercializa a día de hoy bajo distintos nombres comerciales. En distintos estudios se ha mostrado su efectividad para controlar la población de Listeria monocytogenes en lechuga cortada (Oliveira et al., 2015; McManamon, Kaupper, Scollard y Schmalenberger, 2019; Allende et al., 2007). Del mismo modo, se ha determinado su capacidad para controlar la población de Salmonella spp. en el melón cortado (Ukuku y Fett, 2004), la microbiota natural del melón (Ukuku y Fett, 2002) y la población de Listeria monocytogenes y Escherichia coli O157:H7 en el melón entero (Ukuku, Bari, Kawamoto y Isshiki, 2005). En vegetales como el calabacín o el brócoli se han observado reducciones de la población de Listeria monocytogenes superiores a 2,5 unidades logarítmicas con la aplicación de esta bacteriocina (Bari et al., 2005).

Cabe destacar que existen otras bacteriocinas como la coagulina (sobrenadante producido por Lactobacillus paraplantarum IPLA C23), pediocina (producida por Pediococcus acidilactici), bacteriocina RUC9 (producida por una cepa de Lactococcus lactis aislada de ensalada mínimamente procesada) o enterocina AS-48 (producida por Enterococcus faecalis A-48-32) que han mostrado ser efectivas para el control de Listeria monocytogenes en frutas y vegetales (Randazzo, Pitino, Scifò y Caggia, 2009; Cobo-Molinos et al., 2005; Allende et al. 2007). Sin embargo, estas bacteriocinas no se encuentran todavía autorizadas para su uso alimentario. Con el objetivo de incrementar la efectividad, tanto de nisina como de las otras bacteriocinas, en frutas y vegetales, algunos autores han evaluado su combinación con ácidos orgánicos o sustancias quelantes con capacidad antimicrobiana, viéndose incrementada su efectividad significativamente (Bari et al., 2005; Bennik et al., 1999; Cobo-Molinos et al., 2005; Ukuku et al., 2005)

Para incrementar la vida útil de frutas mínimamente procesadas algunos autores han aplicado películas comestibles como soporte de las bacteriocinas. Narsaiah et al. (2015) aplicaron un recubrimiento de alginato que incorporaba pediocina en papaya cortada, observando al finalizar los 21 días de conservación a 4° C una reducción cercana a 4,0 unidades logarítmicas de la población microbiana total. Barbosa, Araújo, Matos, Carneloss y Castro, (2013) aplicaron un recubrimiento de celulosa que incorporaba nisina en mango mínimamente procesado. El tratamiento redujo la población de Listeria. monocytogenes por debajo de los límites de detección después de cuatro días, mientras que en las muestras de control la población alcanzó 10⁶ ufc g^-1. Resultados similares se observaron en la población de Staphylococcus aureus en mango a los seis días de conservación, con una reducción de 6 unidades logarítmicas. Sobre cubos de manzana inoculados con distintas cepas de Listeria monocytogenes, se evaluó la efectividad de distintos recubrimientos solos o combinados con enterocina AS-48 (López Aguayo, Grande Burgos, Pérez Pulido, Gálvez y Lucas López, 2016). Con el tratamiento combinado de carboximetil celulosa y enterocina (40 μg ml^-1) se observó una reducción de 2,7 unidades logarítmicas a los siete días. Con la adición de lactato de sodio o EDTA a todas las combinaciones de recubrimientos y enterocina se consiguió una reducción de la población de Listeria monocytogenes por debajo de los límites de detección en todos los recubrimientos estudiados al cabo de un día con EDTA y a los siete días con el lactato de sodio.

Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan y se multiplican en bacterias específicas y son habitualmente inocuos para humanos, animales y plantas. Son los microorganismos más abundantes en el planeta y están ampliamente difundidos en aguas y alimentos de distintos orígenes (Brüssow y Kutter, 2005). Se clasifican en virulentos (líticos) que siguen generalmente un ciclo lítico y atemperados (lisogénicos) que entran e insertan su DNA en el interior del cromosoma bacteriano y son menos efectivos. El control biológico mediante fagos líticos está empezando a ser aceptado como una tecnología limpia para garantizar la seguridad alimentaria, ya que estos abordan muchas de las preocupaciones actuales de los consumidores. Por una parte, su especificidad hace que únicamente afecten a los microorganismos patógenos y no a la microbiota propia de los alimentos ni a la microbiota del tracto intestinal. Además, son respetuosos con el medioambiente, los fagos se han aislado de él. Los productos comerciales están formulados, en general, con soluciones acuosas, no contienen ni aditivos ni conservantes y su coste es relativamente bajo (Moye, Woolston y Sulakvelidze, 2018). No afectan a la calidad organoléptica del producto. Como inconvenientes, el hecho de que sean muy específicos es, por una parte, ventajoso, pero también puede ser una desventaja; para hacer frente a varios patógenos se necesitará utilizar varios fagos. Además, han de conservarse en refrigeración y su fecha de caducidad es más limitada que la de otros productos.

Existen numerosos estudios que han demostrado la efectividad de determinados bacteriófagos en frutas y hortalizas procesadas. El cóctel de bacteriófagos ECP-100 (actualmente EcoShield^TM) ha demostrado ser efectivo frente a Escherichia coli O157:H7 en tomates, brócoli o espinacas (Abuladze et al., 2008), lechuga y melón cortado (Sharma, Patel, Conway, Ferguson y Sulakvelidze, 2009). El uso de atmósferas modificadas mejoró la efectividad de este fago (Boyacioglu, Sharma, Sulakvelidze y Goktepe, 2013) en lechuga y espinacas. De forma similar, el bacteriófago LMP-102 (actualmente ListShield^TM), efectivo frente a Listeria monocytogenes, se ha ensayado en melón y manzana cortada conservados a 10 °C, mostrando reducciones entre 2 y 0,4 unidades logarítmicas (Leverentz et al., 2003), respectivamente. La efectividad de este producto también se ha probado frente a biofilms sobre lechuga, y superficies de acero inoxidable y caucho, reduciéndolo significativamente en todos los casos. Cabe destacar este efecto en biofilms, ya que estos son difícilmente eliminables mediante otros desinfectantes. Nuestro grupo de investigación evaluó la efectividad del fago Listex P100 frente a manzana, pera y melón cortados y en sus zumos (Oliveira et al., 2014). Los resultados demostraron que, tras ocho días de conservación a 10 °C, el fago no fue efectivo en manzana cortada ni en su zumo, seguramente debido al bajo pH de la manzana que hizo decrecer rápidamente el número de fagos presentes. En pera y melón cortado se obtuvieron reducciones de 1,5 y 1,0 unidades logarítmicas, respectivamente y entre 8,0 y 2,1 unidades en sus zumos. Estas diferencias pueden atribuirse a que, en matrices sólidas, el fago quede inmovilizado y no pueda entrar en contacto con el patógeno debido a su limitada difusión. En lo que se refiere a Salmonella spp. (Leverentz et al., 2001), el fago SCPLX-1 fue efectivo en melón, pero no en manzana. En brotes de soja verde y de semillas de alfalfa, un cóctel de fagos aislados de efluentes de granjas de cerdo y ganado redujeron 3 unidades logarítmicas la población de Salmonella spp., incrementándose esta reducción cuando el fago se combinó con bacterias antagonistas (Ye, Kostrzynska, Dunfield y Warriner, 2010). En este sentido, Leverentz et al. (2003) demostraron también que la combinación del fago LMP-102 con nisina mejoró su efectividad frente a Listeria monocytogenes en melón. La combinación de los fagos con un lavado también puede incrementar su efectividad. Así, Magnone, Marek, Sulakvelidze y Senecal (2013) demostraron que el lavado con ácido levulínico y un cóctel de bacteriófagos (EcoShield^TM, SalmoFresh^TM y ShigaActive^TM), incrementaron la efectividad del tratamiento exclusivo con los fagos en fresa, brócoli y melón cantaloupe. En lechuga cortada Oliveira et al. (2015) compararon la efectividad de distintos bioconservantes frente a Salmonella y Listeria monocytogenes. Ni el fago Salmonellex ni los cultivos bioconservantes ensayados redujeron la población de Salmonella, que no creció durante seis días a 10 °C. Los fagos también pueden incorporarse en recubrimientos alimentarios (Vonasek, Choi, Sanchez y Nitin 2018) con el fin de albergar más fagos y mejorar su estabilidad durante la conservación.

Actualmente, algunos bacteriófagos ya están aprobados para su uso en frutas y hortalizas (véase la tabla 1). En los Estados Unidos, Canadá e Israel prácticamente están todos aprobados, mientras que en la Unión Europea están permitidos como coadyuvantes tecnológicos. El panel de riesgos biológicos de la EFSA (BIOHAZ) emitió una opinión científica sobre el uso de Listex P100 en alimentos listos para el consumo (EFSA, Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), 2016).

Con los métodos utilizados actualmente en la industria de IV gama es difícil obtener frutas y hortalizas mínimamente procesadas totalmente seguras, lo que queda demostrado por el aumento de las toxiinfecciones asociadas al consumo de este tipo de productos. Además, los consumidores demandan productos libres de conservantes químicos. Por ello, la industria necesita implementar nuevas estrategias introduciendo o combinando técnicas sostenibles con las prácticas habituales llevadas a cabo, como la desinfección con hipoclorito sódico, el envasado en atmósferas modificadas y la conservación a temperaturas de refrigeración. La bioconservación, ya sea mediante el uso de cultivos microbianos o sus metabolitos, encaja perfectamente en esta necesidad de la industria.

El uso de cultivos protectores puede reducir el riesgo microbiológico asociado al consumo de frutas y hortalizas mínimamente procesadas y podría, además, alargar su vida útil. Sin embargo, la aplicación de estos cultivos no tiene un efecto inmediato sobre la población de patógenos de transmisión alimentaria, sino que ejerce un efecto protector frente al crecimiento de los mismos durante la conservación del producto. Por lo tanto, su uso debería realizarse en combinación con las actuales técnicas de producción utilizadas habitualmente en productos de IV gama. Además, diversos estudios han demostrado que la presencia de estos cultivos protectores disminuye la capacidad de los patógenos para adherirse e invadir el epitelio intestinal. Con todo, existen una serie de obstáculos para la aplicación práctica de los agentes de biocontrol, entre los que podemos destacar la aceptación por parte del consumidor y los aspectos legislativos. La presencia de microorganismos vivos en los alimentos no es una idea nueva, ya que desde tiempos muy antiguos se han utilizado para conservar alimentos mediante las fermentaciones, por lo que podría ser viable la aceptación de su uso por parte de los consumidores. No obstante, su aceptación legislativa y que obtenga el estatus QPS (Qualified Presumption of Safety), requerido para su autorización en el mercado europeo, pueden ser más complicados, necesitándose estudios sobre su toxicidad y patogenicidad.

Como se ha descrito en multitud de estudios, la aplicación de bacteriocinas en frutas y vegetales no ocasiona ningún defecto visible, siendo capaz de controlar tanto a los microorganismos alterantes como a los patógenos, por lo que se reafirma nuevamente su aptitud como bioconservante en este tipo de alimentos.

En cuanto a los fagos, su efectividad depende de la matriz, del momento y modo de aplicación y de su estabilidad durante la conservación, y su efecto no es inmediato. Así pues, aunque existen aún algunos retos por superar, el control biológico mediante fagos puede ser una tecnología efectiva para la eliminación o reducción de bacterias patógenas que no afecta a otros microorganismos. Finalmente, la aplicación de los fagos no ha de ser un sustituto del lavado, sino que ha de considerarse una tecnología de barrera adicional para garantizar la seguridad de frutas y hortalizas procesadas durante su comercialización.