Los métodos utilizados inicialmente para detectar BAL productoras de AB se basan en el aislamiento de los microorganismos del alimento o del cultivo iniciador y en su posterior crecimiento en un medio de cultivo sólido diferencial suplementado con el aminoácido sustrato y un indicador de pH (por ejemplo, el púrpura de bromocresol) que vira de color cuando el pH del medio se alcaliniza (Bover-Cid y Holzapfel, 1999; Joosten y Northolt, 1989; Maijala, 1993). Si la bacteria tiene actividad aminoácido descarboxilasa y sintetiza la AB correspondiente, el pH del medio aumentaría debido a que la AB producida es más básica que el aminoácido sustrato y se produciría un halo de diferente color alrededor de la colonia productora. Utilizando este tipo de medios diferenciales se han podido detectar cepas de BAL aisladas de cultivos iniciadores o de distintos alimentos capaces de producir diferentes AB (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Carnobacterium divergens, Carnobacterium piscicola, Lactobacillus curvatus, o Lactobacillus brevis entre otras especies (Bover-Cid, Hugas, Izquierdo-Pulido y Vidal-Carou, 2001; Joosten y Northolt, 1989). Estos medios han sido especialmente eficaces para detectar BAL productoras de tiramina (Ladero, Martínez, Martín, Fernández y Álvarez, 2010), ya que este aminoácido es muy insoluble y forma un precipitado opaco en el medio de descarboxilación sólido; el medio se torna transparente alrededor de aquellas cepas productoras de tiramina, haciéndolas fácilmente identificables. Sin embargo, los medios de descarboxilación sólidos no han demostrado ser especialmente eficaces para detectar BAL productoras de histamina, a pesar de que se ha descrito el aislamiento de algunas de estas cepas de alimentos, como Lactobacillus buchneri (Joosten y Northolt, 1989) actualmente identificado como Lactobacillus parabuchneri (Díaz, Río et al., 2016; Díaz, Ladero, Río et al., 2016). Esto se debe a que el ácido láctico producido por estas bacterias contrarresta la alcalinidad de la histamina acumulada y no se produce el viraje de color del indicador de pH. Sin embargo, el uso de medios de descarboxilación líquidos con baja concentración de glucosa ha permitido detectar más cepas productoras de histamina aisladas de alimentos como el queso (Lactobacillus vaginalis (Díaz et al., 2015), Lactobacillus parabuchneri (Díaz, Ladero, Río et al., 2016)). Estos métodos se suelen combinar con métodos analíticos (tales como electroforesis en capa fina (Thin Layer Chromatography, TLC (Latorre-Moratalla, Bover-Cid, Veciana-Nogués y Vidal-Carou, 2009), cromatografía líquida de alta resolución (High Performance Liquid Chromatography, HPLC (Fernández et al., 2007) o cromatografía líquida de ultra alta resolución (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC (Redruello et al., 2013; Redruello et al., 2016)) diseñados para detectar y cuantificar la presencia de la AB en matrices alimentarias, ya que permiten confirmar la presencia de la AB en el medio de cultivo suplementado con el aminoácido correspondiente en el que se ha crecido la bacteria aislada.

Sin embargo, los métodos dependientes de cultivo tienen una serie de desventajas. En primer lugar, requieren el aislamiento de la bacteria del alimento, para lo que muy frecuentemente es necesario hacer cultivos de enriquecimiento que permitan aumentar su proporción en el cultivo, y su posterior crecimiento. Este proceso largo y tedioso no siempre resulta eficaz, ya que puede haber bacterias productoras que no sean capaces de crecer en estos medios de cultivo. Además, como estos medios no son selectivos, el aislamiento puede resultar muy difícil e incluso imposible en el caso de que la bacteria productora se encuentre en una proporción muy baja con respecto al número total de bacterias presentes en el alimento, el cual suele ser muy elevado en el caso concreto de los alimentos fermentados. También hay que tener en cuenta que pueden dar lugar a falsos positivos, si la bacteria produce algún compuesto básico distinto a las AB que sea capaz de alcalinizar el medio. Estos métodos, además, tienen baja sensibilidad y en función de la capacidad de producción y el estado fisiológico de las células ensayadas se pueden producir falsos negativos si la alcalinización debida a la producción de la AB se contrarresta con la acidez producida por el metabolismo fermentativo de las BAL. Además, aquellos que implican la detección de la producción mediante métodos cromatográficos requieren disponer de equipamiento sofisticado (Landete, Rivas, Marcobal y Muñoz, 2007). Por último, aunque no menos importante, estos métodos no son cuantitativos.

Una vez que se ha aislado el microorganismo productor de AB es necesario proceder a su identificación. Frecuentemente, las especies se han identificado de forma errónea, como es el caso de algunas cepas de Lactobacillus parabuchneri aisladas de queso y productoras de histamina que habían sido clasificadas como Lactobacillus buchneri, comentado anteriormente. Algunas de estas especies permanecen mal clasificadas tanto en publicaciones como en las bases de datos, lo que puede dar lugar a identificaciones incorrectas de otros aislados bacterianos y causar problemas en estudios futuros. Esto es debido a que en muchos casos la identificación se realizaba mediante métodos microbiológicos clásicos que se basan en criterios fenotípicos (microscópicos y macroscópicos) y en pruebas bioquímicas (determinación de actividad enzimática, metabolitos producidos, resistencia a antibióticos, etc.), en lugar de utilizar métodos genotípicos mucho más sólidos y precisos como los métodos moleculares basados en la secuenciación de genes con utilidad taxonómica (como gen del ARN ribosomal 16S (rna16S), Super óxido dismutasa (sod), subunidad β de la ARN polimerasa (rpoB), etc.).

Frente a los métodos dependientes de cultivo, los métodos independientes de cultivo, especialmente los métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), presentan varias ventajas destacables, como su gran especificidad y que son métodos rápidos y de fácil realización; de hecho, no es necesario disponer de una gran cantidad de ADN de alta pureza y en muchos casos ni siquiera es necesario un tratamiento previo de la muestra (Río et al., 2007; Martínez et al., 2011). Por lo tanto, estos métodos pueden incorporarse a un laboratorio de alimentos e incluso a plantas de elaboración para el control de la calidad y seguridad microbiológica de los mismos. Además, dependiendo de la técnica utilizada y del diseño específico de la misma, las técnicas basadas en PCR permiten no solo determinar la capacidad de producción de aminas biógenas de una cepa, sino que pueden ser utilizadas para la cuantificación de bacterias productoras en los alimentos e incluso identificar las poblaciones presentes en los mismos (véase figura 3), lo que puede ayudar a tomar las medidas adecuadas para evitar la acumulación de aminas biógenas en cada tipo de alimento y estadio de elaboración (Ladero, Fernández y Álvarez, 2009; Landete, Rivas, Marcobal y Muñoz, 2011; Martínez et al., 2011).

Para el diseño de un método de detección bacteriana basado en PCR se necesita disponer de primers adecuados. Para poder diseñar los primers que nos permitan detectar específicamente los genes diana se hace necesario un conocimiento previo de estos genes y su comparación entre las bacterias portadoras. En el caso de los genes implicados en la producción de aminas biógenas, como hemos visto anteriormente, en los últimos años se ha realizado una descripción exhaustiva de estos genes en una gran variedad de géneros y especies, por lo que se dispone de suficiente información genética para su diseño. En algunos casos, si las secuencias de nucleótidos son muy divergentes, puede ser necesario el uso de más de una pareja de primers. Este es el caso de las bacterias con capacidad de producir histamina en alimentos, ya que pertenecen a grupos muy dispares, Gram negativas en pescados y derivados de los mismos y Gram positivas del grupo de las BAL en alimentos fermentados. En estos casos, se puede utilizar el método de PCR más adecuado según el grupo bacteriano que se intenta detectar o bien se realizan dos PCR, o se puede diseñar una PCR múltiple (Coton et al., 2010; Rivas, Marcobal y Muñoz, 2005).

La PCR fue el primer desarrollo de técnicas independientes de cultivo para la detección de productores de AB. A partir de los genes implicados en la producción de AB cuyas secuencias estaban disponibles, se diseñaron primers específicos para la detección de productores de histamina (Le Jeune, Lonvaud-Funel, ten Brink, Hofstra y van der Vossen, 1995) y tiramina (Lucas y Lonvaud-Funel, 2002). En algunos casos, se llegó a relacionar la presencia de una AB, como por ejemplo la tiramina en quesos, con amplificaciones específicas de los genes (Fernández, Flórez, Linares, Mayo y Álvarez, 2006). Sin embargo, debido al hecho de que además de la presencia de los productores, hay más factores implicados en la acumulación de AB, pronto comenzaron a desarrollarse otras técnicas que además de la detección permiten la cuantificación e incluso la identificación de los productores. Sin embargo, la técnica de la PCR sigue teniendo mucha utilidad en la selección de cepas que puedan ser utilizadas como cultivos iniciadores en la elaboración de alimentos fermentados (Ladero et al., 2015). Una simple PCR nos dirá si las cepas candidatas poseen genes de producción de AB y por lo tanto deban ser descartadas como cultivo iniciador, evitando el riesgo de acumulación de AB en grandes cantidades. Existen diversas PCR orientadas a la detección de los genes de producción de histamina, tiramina y putrescina (Costantini, Cersosimo, Prete y García-Moruno, 2006; Fernández, Linares y Álvarez, 2004; Ladero, Rattray et al., 2011; Marcobal, Rivas, Moreno-Arribas y Muñoz, 2005), que se han aplicado en la selección de cepas iniciadoras en vino, carne o productos lácteos. En productos lácteos hay que destacar el caso de Lactococcus lactis, principal especie utilizada como cultivo iniciador en la elaboración de quesos. Como se ha comentado anteriormente, aunque la capacidad de producción de putrescina se considera una característica de especie, no todas las cepas la presentan debido a su pérdida durante el proceso de domesticación al entorno lácteo. En algunas cepas, la incapacidad de producir putrescina se debe a una secuencia de inserción que interrumpe la transcripción del operón que constituyen los genes responsables de la producción de putrescina, incluido el gen agdi, que es el gen diana de la PCR. Por lo tanto, la presencia del gen agdi en una cepa de Lactococcus lactis es necesaria pero no suficiente para asegurar que produce putrescina (Ladero, Rattray et al., 2011). Para evitar este problema se ha diseñado una PCR alternativa a las de detección de agdi utilizada para la selección de iniciadores en otros productos como el vino o la sidra (Coton et al., 2010), en la que los primers, además de detectar la presencia del cluster AGDI permiten comprobar si este está inactivado o no, facilitando el proceso de selección (Ladero, Rattray et al., 2011).

El hecho de que existan varias AB con relevancia en la calidad y seguridad alimentaria y de que una misma cepa pueda producir más de una AB implica que hay que realizar varias PCR para confirmar la seguridad de estas cepas. Por ello, diversos autores han diseñado nuevos primers que no solo detectan la presencia de los genes, sino que con el diseño adecuado los tamaños que genera la amplificación de cada uno de los genes se diferencian unos de otros (Marcobal, Rivas, Moreno-Arribas y Muñoz, 2005; Rivas, Marcobal, Carrascosa y Muñoz, 2006), incluyendo en algún caso un control positivo de amplificación que le da mayor robustez al método (Coton y Coton, 2005; Coton et al., 2010). De esta forma, en una única reacción se puede comprobar la capacidad de una cepa para producir cualquier AB y consecuentemente descartarla para su uso como cultivo iniciador, aumentando la seguridad de los alimentos fermentados.

Una evolución de estos métodos de detección de la capacidad de producir AB basados en PCR fue su adaptación al uso de la PCR cuantitativa (qPCR). La qPCR añade a las ventajas de la PCR convencional una mayor rapidez -el resultado se puede obtener en menos de dos horas- y la capacidad de cuantificar el número de copias del gen diana (Martínez et al., 2011). Esto nos permite ver la cantidad de productores de AB presentes en un alimento y seguir su evolución a lo largo del proceso de elaboración y conservación hasta su llegada al consumidor, constituyendo una herramienta de prevención, ya que si en las condiciones de conservación o maduración empleadas se observa un aumento de la población de productores de AB se pueden tratar de aplicar las medidas correctoras adecuadas, como reducir la temperatura de almacenamiento, acortar la vida útil, etc… Además, con un adecuado diseño de los primers la qPCR también permite la realización de estudios poblacionales, pudiendo cuantificar la presencia de diferentes especies productoras (Ladero, Calles-Enríquez, Fernández y Álvarez, 2010; Ladero, Cañedo et al., 2012).

Existen diferentes métodos de qPCR para la detección de bacterias productoras de AB (Bjornsdottir-Butler, Jones, Benner y Burkhardt, 2011a; Fernández, Río, Linares, Martín y Álvarez, 2006; Ladero, Calles-Enríquez, Fernández y Álvarez, 2010; Ladero, Cañedo et al., 2012; Lucas, Claisse y Lonvaud-Funel, 2008; Podeur et al., 2015) que se han aplicado al estudio de la presencia de productores en pescados, quesos, vinos, sidras o carnes, pudiendo determinarse límites de la presencia de estos productores que supongan un riesgo para la acumulación de concentraciones de AB por encima de los límites recomendados (Bjornsdottir-Butler et al., 2011b; Ladero, Linares, Fernández y Álvarez, 2008; Ladero, Martínez, Martín, Fernández y Álvarez, 2010, Ladero, Coton et al., 2011; Nannelli et al., 2008; Torriani et al., 2008). Incluso se ha utilizado para determinar la fuente de contaminación de bacterias productoras durante el procesamiento post-maduración de quesos (Ladero et al. 2009).

La DGGE es una técnica que, gracias a la electroforesis en gradiente de desnaturalización, generalmente originado por un gradiente de urea u otro agente desnaturalizante como pueda ser la temperatura, permite una separación efectiva de fragmentos de ADN de igual tamaño, pero que difieren en su secuencia nucleotídica, permitiendo por tanto diferenciar variantes de un mismo gen. Esta técnica se ha usado ampliamente para ver diferencias y evolución de poblaciones microbianas en distintos ecosistemas, incluyendo alimentos (Cocolin et al., 2007; Smidt, 2016; Flórez y Mayo, 2006), mediante la separación de fragmentos de PCR correspondientes a genes de valor taxonómico, como puede ser el gen 16S ribosomal. Esta herramienta se puede adaptar a otros genes, como puedan ser los responsables de la producción de AB, lo que permite el estudio de las poblaciones de productores de AB y tener una visión global de las especies implicadas. Aunque no es una técnica cuantitativa, sí permite ver la evolución de los diferentes grupos de productores de AB de forma cualitativa. Tras la electroforesis, se obtienen patrones de bandas que en muchos casos se pueden asignar directamente a especies concretas. Esta técnica se ha empleado en el estudio de la presencia de productores de histamina en queso (Díaz, Ladero, Redruello et al., 2016), lo que por un lado permitió identificar especies que no se pensaba que pudiesen estar presentes en los quesos, como Tetragenococcus halophilus, y por otro determinar que el principal responsable de la acumulación de histamina en altas concentraciones en queso es Lactobacillus parabuchneri, lo que abrió la puerta al inicio de estudios focalizados en una mejor comprensión de su fisiología y genética para poder diseñar medidas preventivas específicas que impidan el crecimiento y desarrollo de esta especie productora de histamina (Díaz, Ladero, Río et al. 2016; Díaz et al., 2018; Wuthrich et al., 2017).

El desarrollo de las nuevas técnicas ómicas, y más concretamente las técnicas de secuenciación masiva, así como el abaratamiento de las mismas, ha tenido y seguirá teniendo un gran impacto en la microbiología de alimentos y particularmente en calidad y seguridad alimentaria (Mayo et al., 2014; Walsh, Crispie, Claesson y Cotter, 2017). En el caso concreto del estudio de métodos para la detección de cepas productoras de AB, tiene un gran potencial. Actualmente la secuenciación completa del genoma de las cepas se considera la forma más completa de caracterizar las cepas bacterianas con potencial para ser incluidas en cultivos iniciadores en las fermentaciones alimentarias, ya que por un lado se pueden ver las características tecnológicas relacionadas con el proceso de fermentación y además verificar la seguridad e inocuidad de dichas cepas, incluyendo la capacidad de producir AB. En los últimos años se han secuenciado una gran variedad de cepas productoras de AB de diferentes géneros y especies (Bjornsdottir-Butler, Leon y Benner, 2016; Ladero et al., 2013; Ladero et al., 2014; Romano, Trip, Lolkema y Lucas, 2013; Wuthrich et al., 2017). Estos estudios se han utilizado para determinar el origen de los genes implicados en la producción de AB (Wuthrich et al., 2017), para identificar nuevas rutas de producción (Romano et al. 2013), o realizar estudios fisiológicos para profundizar en las condiciones que afectan a su acumulación en alimentos (Río et al., 2016; Pérez et al., 2017).

Otra técnica con gran impacto en microbiología de alimentos ha sido la metataxonómica, que mediante la secuenciación masiva de amplicones de regiones variables de genes de interés taxonómico, principalmente el gen de la subunidad 16S ribosomal permite conocer la distribución de especies bacterianas presentes en una muestra (Alegría, Szczesny, Mayo, Bardowski y Kowalczyk, 2012). Recientemente, se ha adaptado esta técnica a la amplificación de fragmentos internos de los genes que codifican la tirosina y la histidina descarboxilasas (O’Sullivan et al., 2015). Estos estudios han permitido identificar a Enterococcus faecalis como el principal responsable de la producción de tiramina en quesos o corroborar a Lactobacillus parabuchneri como el responsable de la producción de histamina en productos lácteos (O’Sullivan et al., 2015), si bien, debido a la necesidad de conocimientos de bioinformática que adapten los métodos y las bases de datos de referencia existentes al caso concreto de la producción de AB, este tipo de estudios son muy escasos.