Las alergias alimentarias son uno de los principales problemas sanitarios que actualmente afectan a la mayor parte de los países industrializados. La Organización Mundial de la Alergia (WAO) destaca en su último informe la gran prevalencia que han experimentado estas enfermedades en los últimos veinte años, una tendencia que no muestra signos de moderación. Este considerable incremento está en estrecha correlación con la globalización de los mercados, con la mejora en la calidad de vida y con el control de las enfermedades infecciosas durante la infancia. Así, en la Unión Europea (UE), la alergia alimentaria es la enfermedad crónica más común en la edad infantil, llegando a tasas mayores del 6% en algunos países. En España, la prevalencia de este tipo de enfermedades en la población general es de un 3-4% (Sicherer y y Sampson, 2014).

Un total de catorce alimentos (pescado, crustáceos, moluscos, gluten, huevos, lácteos, cacahuetes, soja, apio, frutos de cáscara, mostaza, granos de sésamo y dióxido de azufre-sulfitos y altramuces) están declarados como alérgenos por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (European Food Safety Authority, EFSA).

En pacientes sensibilizados, los síntomas clínicos de la alergia alimentaria normalmente se manifiestan por medio de urticarias, conjuntivitis, rinitis, problemas gastrointestinales y dificultad respiratoria, dando lugar en el peor de los casos a un shock anafiláctico minutos después de la ingesta (Sampson, 2003).

Para garantizar la seguridad de los consumidores, la Comisión Europea en su Directiva 2007/68/EC obliga a los distintos países a declarar y asegurar la presencia de cualquier alérgeno o derivado del mismo en el etiquetado de todos los productos alimenticios. Asimismo, la autoridad de la EFSA reconoció la alta prevalencia y alto riesgo en todo el mundo y reclamó a la comunidad científica la necesidad de desarrollar nuevos métodos de control y detección de dichos alérgenos en los productos alimentarios.

La alergia alimentaria presenta un origen multifactorial en donde se incluyen factores genéticos, inmunológicos y ambientales (Lorente, Laffond, Dávila y Moreno, 2001). Es una hipersensibilidad alergénica tipo I mediada por la producción amplificada de inmunoglobulina E (IgE). Establecido el diagnóstico de alergia alimentaria, la exclusión del alimento alergénico, manteniendo los requerimientos nutricionales, es en la actualidad el único tratamiento apropiado para prevenir reacciones futuras. Hallar nuevas terapias para las alergias alimentarias, más allá de la simple supresión de la ingesta del alimento alergénico, forma parte de los objetivos actuales de la ciencia.

En este sentido, las poderosas metodologías -ómicas (Genómica, Proteómica, Metabolómica, etc) y de biología de sistemas están logrando un gran impacto en toda la comunidad científica. De hecho, a instancias de la comunidad científica dedicada al estudio de los alimentos, se ha establecido una nueva disciplina denominada Foodomics (Cifuentes, 2009; Herrero, Simó, García-Cañas, Ibánez y Cifuentes, 2012).

En esta revisión se describen los avances más recientes en las técnicas de proteómica de descubrimiento y dirigida (Discovery Proteomics y Targeted Proteomics), así como de las herramientas de biología de sistemas para el control y detección de alérgenos en los alimentos y para alcanzar una mayor comprensión de las bases moleculares de la alergia alimentaria (véase la figura 1). Resultados de gran transcendencia que están siendo útiles no solo para toda la comunidad científica sino también para las autoridades sanitarias e industrias alimentarias y farmacéuticas con el fin de garantizar la seguridad y proteger la salud de los consumidores.

La proteómica de descubrimiento tiene como finalidad el estudio y caracterización a gran escala de los componentes de un determinado proteoma. Se basa en la identificación y cuantificación de las proteínas, la caracterización de sus modificaciones post-traduccionales (PTMs) y la identificación de péptidos y proteínas biomarcadoras. Así, las aproximaciones clásicas de la proteómica Bottom-up son prometedoras tecnologías para la caracterización e identificación de alérgenos alimentarios. Siguiendo esta metodología, la(s) proteína(s) de interés son sometidas a separación mediante electroforesis bidimensional (2-DE), electroforesis capilar (CE) o cromatografía líquida (LC), para a continuación ser digeridas utilizando enzimas (por ejemplo, tripsina) y los péptidos resultantes son entonces analizados por espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Utilizando herramientas de búsqueda en las bases de datos, como SEQUEST, los espectros de fragmentación son asignados a posibles secuencias peptídicas y las asignaciones son seguidamente validadas utilizando programas como Percolator. Hasta la fecha, utilizando aproximaciones similares varias proteínas alergénicas han sido identificadas y caracterizadas (véase la tabla 1). Así, utilizando 2-DE, inmunobloting con sueros de pacientes alérgicos y análisis por espectrometría de masas con un analizador de tiempo de vuelo y desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF) o por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) fueron identificados nuevos alérgenos de crustáceos, sésamo, avellana, pistacho, fruta y gluten (Marzban, Herndl, Maghuly, Katinger y Laimer, 2008; Ortea, Cañas y Gallardo, 2009; Carrera, Cañas, Vázquez y Gallardo, 2010; Martínez-Esteso et al., 2016; Grishina, Bardina y Grishin, 2017).

Una novedosa estrategia desarrollada por nuestro grupo de investigación permitió la secuenciación de novo completa de nuevos alérgenos alimentarios (Carrera et al., 2010). Esta estrategia fue aplicada para la caracterización de todas las parvalbúminas beta (β-PRVBs) de todas las especies comerciales de la familia Merlucciidae. Las β-PRVBs están consideradas como el principal alérgeno de los pescados (Elsayed y Bennich, 1975). Esta metodología se basa en la combinación de la estrategia clásica de la proteómica Bottom-up mediante geles 2-DE, la determinación de la masa molecular exacta de las proteínas intactas mediante espectrometría de masas de resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (FTICR-MS) y la monitorización de los péptidos teóricos necesarios para completar las secuencias faltantes mediante monitorización de la fragmentación de un ion seleccionado (SMIM) en un espectrómetro de masas con un analizador de trampa iónica lineal (LTQ). Así, con esta estrategia se logró la secuenciación de novo completa de veinticinco nuevas isoformas de β-PRVBs (Carrera et al., 2010).

La proteómica dirigida es una estrategia que permite el análisis selectivo de un determinado número de proteínas o péptidos seleccionados que normalmente son considerados como biomarcadores. Para ello el analizador del espectrómetro de masas es programado para que se centre en el análisis de determinados compuestos de interés mediante monitorización de la reacción de un ion/múltiples seleccionado(s) (SRM/MRM) en analizadores tipo triple cuadrupolo (QqQ) o híbridos cuadrupolo-trampa iónica (Q-Trap) o mediante SMIM (Jorge et al., 2007). Además, en equipos de espectrometría de masas de alta resolución (HRMS), como los espectrómetros de masas tipo Q-Orbitrap, se logra una mejora en la velocidad, sensibilidad y rango dinámico de la monitorización, denominándose en este caso monitorización de la reacción en paralelo de un ion/múltiples seleccionado(s) (PRM). Estos últimos modos de trabajo (SMIM/PRM) son los más avanzados y presentan dos importantes ventajas frente a los otros modos de barrido: por un lado, consiguen un considerable incremento en la sensibilidad debido al promedio de varios espectros de fragmentación (MS/MS), de principal importancia para confirmar la naturaleza o secuencia de la especie identificada, y por el otro, es un modo de trabajo que permite obtener cromatogramas virtuales para los diferentes iones fragmento.

En el caso de la alergia alimentaria, la proteómica dirigida se ha aplicado para la detección y cuantificación en los productos alimenticios de la presencia o no de determinados alérgenos alimentarios (véase la tabla 1). Así, la monitorización mediante LC-SRM/MRM en instrumentos tipo QqQ o Q-Trap ha permitido la detección y cuantificación específica de la presencia de gluten, huevos, lácteos, soja, avellanas, nueces, almendras o cacahuetes en productos alimenticios (Pilolli, Angelis y Monaci, 2017; Angelis, Pilolli y Monaci, 2017; Ansari, Stoppacher, Rudolf, Schuhmacher y Baumgartner, 2011; Careri, Elviri, Lagos et al., 2008; Cryar et al., 2012; Heick, Fischer y Pöpping, 2011; Lutter, Parisod y Weymuth, 2011; Martínez-Esteso et al., 2016; Pedreschi, Nørgaard y Maquet, 2012; Sealey-Voyksner, Khosla, Voyksner y Jorgenson, 2010) (véase la tabla 1). Asimismo, utilizando instrumentos de alta resolución como el Q-Orbitrap fue posible la detección a nivel de trazas de alérgenos de cacahuetes, leche o huevos en otros productos alimenticios (Monaci, Angelis, Bavaro y Pilolli, 2015; Monaci, Losito, Angelis, Pilolli y Visconti, 2013; Monaci, Losito, Palmisano y Visconti, 2011). Por otra parte, hay que destacar que nuestro grupo de investigación desarrolló una novedosa metodología para la detección de todas las β-PRVBs de pescado en cualquier producto alimenticio (Carrera, Cañas y Gallardo, 2012). El método se basa en los siguientes pasos: (i) purificación rápida de las β-PRVBs (proteínas termoestables) por tratamiento con calor (tiempo: 45 min.), (ii) digestión ultrarrápida con tripsina empleando ultrasonidos de alta intensidad focalizados (HIFU) (tiempo: 2 min.), y (iii) monitorización mediante SMIM de los péptidos biomarcadores para la detección de las β-PRVBs en un LTQ (tiempo: 60 min.). Esta estrategia permite la detección directa del principal alérgeno de los pescados (β-PRVBs) en cualquier producto alimenticio en menos de dos horas. Es el método más rápido descrito hasta el momento. Esta estrategia también se ha aplicado para la detección de la proteína alergénica y termoestable Ani s 9, específica de los Anisákidos, en cualquier producto alimenticio (Carrera, Gallardo, Pascual, González y Medina, 2016).

Por otra parte, los espectrómetros de masas en modo de adquisición independiente de datos (DIA) en equipos de HRMS o en equipos de movilidad iónica (DIA-IM-MS) han permitido la detección de trazas de huevo, leche o cacahuetes en varios alimentos (Johnson et al., 2016; Monaci et al., 2013). Finalmente, los métodos de proteómica Top-Down permiten la detección y cuantificación de los alérgenos alimentarios a nivel de proteína intacta sin necesidad de digestión previa con enzimas. Para ello, se necesitan de equipos HRMS como el FTICR-MS o el Orbitrap Fusion implementada con fotodisociación inducida por ultravioleta UVPD. Estos métodos se han aplicado para la detección de leche en muestras de zumos de frutas (Monaci y van Hengel, 2008) y para la detección de β-PRVBs en pescado (Carrera et al., 2015).

La biología de sistemas es una ciencia integradora que utiliza la información obtenida de las ciencias -ómicas, como la proteómica, junto con las herramientas bioinformáticas y la modelización computacional para entender y predecir las propiedades de los sistemas biológicos desde un punto de vista holístico.

Aunque la respuesta de los linfocitos T y B a un alérgeno presenta un proceso similar a la respuesta frente a un antígeno convencional, es decir, el linfocito T (del tipo Th2) reconoce un péptido del alérgeno procesado y presentado por una célula presentadora de antígeno en la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II, lo que desemboca en la cooperación y diferenciación de los linfocitos B para dar lugar a células plasmáticas secretoras de IgE, parece ser que su inapropiado mecanismo de activación presenta un papel fundamental en la etapa de sensibilización de los pacientes atópicos (Maggi, 1998). Por esta razón, la investigación de los mecanismos moleculares de esta inapropiada activación de las células T y B es de gran interés científico, no solamente para comprender mejor los procesos alergénicos sino también para entender todos aquellos procesos de respuesta inapropiada de los linfocitos, en donde se interrumpe la tolerancia inmunológica. Así las novedosas técnicas de biología de sistemas permitirán desarrollar modelos computacionales de los mecanismos de transducción de señales y de activación de los linfocitos T y B en los casos de alergia alimentaria. Dichos modelos podrían identificar potenciales dianas diagnósticas y terapéuticas. En vista de esto, nuestro grupo está trabajando en herramientas de biología de sistemas utilizando datos proteómicos para alcanzar una mayor comprensión de las bases moleculares de la alergia al pescado. Para ello, se están desarrollando estudios de activación de las células T en casos de alergia al pescado, involucrando principalmente cambios en la abundancia proteica, interacciones proteína-proteína y modificaciones post-traduccionales (PTMs), principalmente fosforilaciones (Carrera, Cañas. y López-Ferrer, 2017). Así la aplicación de estas herramientas de biología de sistemas y simulación matemática culminarán con la generación de un modelo in-silico que prediga el comportamiento de las células T en el caso de la alergia al pescado. Este modelo tendrá un impacto directo en la identificación de potenciales dianas para el desarrollo de nuevos fármacos que logren el tratamiento y control de estas enfermedades alérgicas.

En esta revisión se resumen las capacidades de la proteómica y de la biología de sistemas para el estudio de la alergia alimentaria. La combinación de las dos principales estrategias proteómicas (Descubrimiento y Dirigida) han permitido la secuenciación de novo completa de nuevos alérgenos alimentarios. Asimismo, la monitorización de varios péptidos biomarcadores de alérgenos mediante SMIM o PRM permite la detección rápida de los alérgenos en cualquier producto alimenticio en menos de 2 horas.

Por otra parte, la aplicación de la cuantificación absoluta mediante AQUA-LC-MRM (Ahsan, Rao, Gruppuso, Ramratnam y Salomon, 2016), el uso de la electroforesis capilar (CE) acoplada a aproximaciones de proteómica Top-Down en instrumentos de HRMS (Álvarez, Montero, Llorens, Castro-Puyana y Cifuentes, 2018), la proteómica Cross-Talk y el empleo de los nuevos modos de fragmentación como HCD (high-collision dissociation), ETDhcD (electron-transfer-high-collision dissociation) y UVPD (ultraviolet photo-dissociation) para lograr la secuenciación de novo completa de proteínas intactas, son las nuevas perspectivas que se están empezando a utilizar en el campo de la alergia alimentaria. Además, la incorporación de estos resultados en sistemas portátiles, nano-biosensores tipo lab-on-a-chip, arrays de proteínas o sistemas de microfluídica (Neethirajan, Weng, Tah, Cordero y Ragavan, 2018), ofrecen nuevas ventajas para la industria alimentaria y las autoridades de control alimentario para poder realizar los análisis de control de los alérgenos alimentarios en sus propias compañías sin necesidad de personal especializado e instrumentación costosa con el fin de garantizar al consumidor una seguridad alimentaria.